Comment identifier une bactérie

L'identification des bactéries est une tâche complexe. L'une des raisons est que, selon des estimations, il y a entre 10 000 et un milliard d'espèces bactériennes dans le monde ! Identifier correctement les bactéries est très important, en particulier dans le domaine médical, où le traitement adéquat d'une maladie dépend en grande partie du type de microbe qui est à l'origine du problème. Dans la plupart des cas, l'identification est faite sur la base de l'élimination. Pour identifier une bactérie, vous devez effectuer des tests de coloration, analyser son apparition et observer comment elle réagit bien à des conditions différentes. Si vous avez besoin d'un résultat rapide, prélevez un échantillon d'ADN à envoyer à un laboratoire.

Méthode 1

Méthode 1 sur 4:

Identifier une bactérie par la coloration de Gram

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Déterminez si les bactéries sont à Gram positif ou négatif. La coloration de Gram est une méthode qui permet de diviser les bactéries entre les deux types les plus courants : Gram positif et Gram négatif. Les premiers ont une paroi cellulaire épaisse constituée d'un polymère appelé peptidoglycane, qui détient une meilleure coloration que les parois minces de bactéries à Gram négatif ^{[1]XSource de recherche}.
- Certains genres communs de bactéries à Gram positif sont les streptocoques, les staphylocoques, les micrococcus (ou microcoques) et les listérias.
- Voici quelques exemples courants de genres de bactéries à Gram négatif : Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium et Campylobacter.
Les bactéries et les éléments chimiques que vous utiliserez lors du test présentent un risque pour votre santé. Porter des lunettes de protection, des gants jetables en nitrile et une blouse de laboratoire au moment d'effectuer le test de coloration. Une fois que vous aurez terminé, mettez les gants et tous les autres matériaux contaminés dans un sac spécial. N'oubliez pas de suivre les procédures de votre laboratoire pour vous débarrasser du sac pour produits contaminés ^{[2]XSource fiableCenters for Disease Control and PreventionAller sur la page de la source}.
Pour commencer le test, placez une goutte ou un morceau d'échantillon bactérien sur une lame stérile. Ensuite, faites glisser la lame sur un bec Bunsen allumée trois fois pour fixer l'échantillon ^{[3]XSource de recherche} et l'empêcher de sortir de la plaque lorsque vous rincez ou ajoutez les réactifs.
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Ajoutez 5 gouttes de cristal violet à la lame. Versez cinq gouttes d'une solution de cristal violet sur l'échantillon. Attendez une minute pour que l'échantillon absorbe le cristal violet ^{[4]XSource de recherche}.
- Maintenez la lame en place avec des épingles à linge afin de ne pas vous tacher les mains ^{[5]XSource de recherche}.
Utilisez un robinet ou une bouteille compressible et laissez l'eau s'écouler très lentement pendant un maximum de cinq secondes ^{[6]XSource de recherche} pour éliminer les résidus d'encre qui n'ont pas adhéré à l'échantillon.
Il s'agit d'une solution composée d'iode, de bicarbonate de sodium et d'iodure de potassium ^{[7]XSource de recherche} qui provoque la fusion du cristal violet avec les parois cellulaires de la bactérie. Versez cinq gouttes de la solution sur l'échantillon et laissez agir pendant une minute ^{[8]XSource de recherche}.
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Lavez l'échantillon avec de l'alcool ou de l'acétone. L'alcool et l'acétone sont des agents décolorants et élimineront la coloration des parois des cellules bactériennes si elles sont à Gram négatif. Versez quelques gouttes d'eau de Javel sur l'échantillon et laissez agir pendant au plus trois secondes. Après cela, essayez de rincer doucement avec de l'eau pendant cinq secondes pour éliminer ces agents décolorants ^{[9]XSource de recherche}.
- Si vous laissez le décolorant agir pendant une longue période, il peut en résulter la disparition de la coloration de la bactérie à Gram positif, entrainant un faux négatif.
La safranine est un colorant rouge qui contraste avec le cristal violet, colorant ainsi les bactéries non affectées par la coloration au violet. Versez environ cinq gouttes de safranine sur l'échantillon et laissez agir pendant une minute. Après cela, essayez de rincer doucement avec de l'eau pendant cinq secondes ^{[10]XSource de recherche}.
La bactérie deviendra violette ou pourpre si elle est à Gram positif ou rose si elle est à Gram négatif à cause de la safranine ^{[11]XSource de recherche}.
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Méthode 2

Méthode 2 sur 4:

Effectuer le test de coloration de Ziehl-Neelsen

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Ces espèces contiennent une plus grande quantité de lipides, ce qui les rend plus résistantes aux colorants utilisés dans la coloration de Gram. Les bactéries résistantes aux acides appartiennent au genre Mycobacterium, qui comprend la bactérie responsable de la tuberculose (M. tuberculosis). Pour teindre une bactérie résistante aux acides, vous devez utiliser un colorant rouge appelé fuchsine phéniquée, résistant au rinçage avec des solutions d'alcool acide ou d'acide sulfurique ^{[12]XSource de recherche}.
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Prenez les mesures de protection appropriées. Les matières chimiques et biologiques utilisées pendant la coloration de Ziehl-Neelsen peuvent être dangereuses. En outre, vous devrez également utiliser des sources de chaleur, telles qu'une buse Bunsen, un radiateur électrique ou une lampe à alcool. Suivez les instructions ci-dessous pour effectuer le test ^{[13]XSource de recherche}.
- Mettez des lunettes de protection, des gants en nitrile et une blouse de laboratoire ^{[14]XSource de recherche}.
- Veillez à ne pas inhaler les vapeurs des colorants et des agents de blanchiment et à ne pas laisser des gouttelettes éclabousser vos yeux ou votre peau. Gardez les contenants ouverts sous une hotte ^{[15]XSource de recherche}.
- Faites très attention lorsque vous réchauffez la lame. La plupart des produits chimiques utilisés sont inflammables. Il peut également y avoir des traces de substances inflammables sur les glissières ou d'autres équipements ^{[16]XSource de recherche}.
Avec des mouvements circulaires, étalez uniformément une petite quantité de l'échantillon bactérien au centre d'une lame stérile. Votre échantillon doit occuper environ 10 mm sur 20 mm ^{[17]XSource de recherche}.
Placez la lame sur la structure de séchage avec l'éprouvette tournée vers le haut. Laissez sécher naturellement pendant 30 secondes ^{[18]XSource de recherche}. N'essayez pas de sécher la lame avec un chiffon.
Avec l'éprouvette dirigée vers le haut, faites glisser la lame deux ou trois fois sur un bec Bunsen allumé. Vous pouvez également placer la lame sur un appareil de chauffage électrique en réglant la température entre 65 °C et 75 °C pendant au moins deux heures ^{[19]XSource de recherche}. Veillez à ne pas faire bouillir ni bruler l'échantillon.
Versez plusieurs gouttes de cette solution sur la lame. Versez-en suffisamment pour recouvrir complètement l'échantillon ^{[20]XSource de recherche}.
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Chauffez la lame pour fixer le colorant. Réchauffez soigneusement la lame sur un bec Bunsen ou une lampe à alcool avec l'échantillon dirigé vers le haut, ou placez-la sur un appareil de chauffage électrique. Chauffez la lame à 60 °C ou jusqu'à ce qu'elle commence à libérer de la vapeur. Laissez le colorant agir pendant cinq minutes ^{[21]XSource de recherche}.
- Si vous utilisez un appareil de chauffage électrique, allumez-le à 60 °C. Si vous optez pour la lampe à alcool ou le bec Bunsen, vous devriez vous attendre à voir des vapeurs.
- Pour maintenir la lame à la température souhaitée pendant cinq minutes, réchauffez-la de façon intermittente ^{[22]XSource de recherche}.
- Veillez à ne pas faire bouillir, bruler ou sécher l'échantillon.
Laissez-la refroidir pendant cinq minutes et rincez-la délicatement pendant quelques secondes à l'eau claire. Utilisez l'eau du robinet ou une bouteille compressible pour éliminer les traces de colorant qui n'ont pas adhéré à l'échantillon ^{[23]XSource de recherche}.
Utilisez un volume d'alcool de 3 % en volume (v/v) ou de l'acide sulfurique à 20 % pour recouvrir complètement l'échantillon. Laissez l'acide agir jusqu'à ce que la coloration s'estompe et atteigne une teinte rose très brillante ^{[24]XSource de recherche}. Le processus prend habituellement environ dix minutes ^{[25]XSource de recherche}.
Lavez délicatement la lame sous un robinet ou à l'aide d'une bouteille compressible. Enlevez bien tous les résidus d'acide et de colorant ^{[26]XSource de recherche}.
Une fois que vous aurez rincé la lame, versez sur le colorant du vert de malachite ou du bleu de méthylène. Ces deux solutions créent un fond bleuâtre ou verdâtre sur lequel le colorant rouge ressortira, ainsi que d'autres matières biologiques, telles que des cellules humaines et des bactéries non résistantes aux acides. Laissez les substances agir pendant une à deux minutes ^{[27]XSource de recherche}.
Rincez-la soigneusement avec de l'eau pour éliminer l'excès de contraste. Une fois que vous aurez terminé, séchez l'arrière de la lame avec un chiffon sec et laissez sécher naturellement sur un support ^{[28]XSource de recherche}.
Les bactéries résistantes aux acides deviendront rouges ou rose foncé. Les autres bactéries, les cellules non bactériennes et la base de la lame deviendront vertes ou bleues ^{[29]XSource de recherche}.
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Méthode 3

Méthode 3 sur 4:

Étudier le comportement et l'apparence des bactéries

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Analysez la forme des bactéries. Après avoir fait le test de coloration pour déterminer si les bactéries sont à Gram positif, à Gram négatif, ou résistantes aux acides, il est temps d'identifier plus précisément l'espèce. En premier lieu, analysez la forme des bactéries sur la lame. Les trois formes les plus courantes sont les coccus (sphériques), les spirales et les bacilles (forme de bâtonnets).
- Il existe plusieurs variantes de ces formes. Les bactéries de forme arrondie (coccus), par exemple, peuvent apparaitre par paires (diplocoques), par chaines, en tas ou par groupes de quatre (tétrades).
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Découvrez si la bactérie est aérobie ou anaérobie. Prélevez deux échantillons de bactéries et créez deux cultures distinctes. L'une d'elles doit être anaérobie (cultivée sans oxygène), tandis que l'autre doit être aérobie (cultivée avec de l'oxygène). Conservez la culture anaérobie à 35 °C dans un endroit sans oxygène pendant au moins 48 heures avant d'observer la croissance ^{[30]XSource de recherche}.
- Si des bactéries se développent dans un environnement sans oxygène, mais pas lorsqu'elles sont exposées à de l'oxygène, cela signifie qu'elles sont anaérobies.
- Même si elles se développent dans un environnement oxygéné, mais pas en l'absence d'oxygène, elles sont aérobies.
- Quand elles se développent dans les deux milieux, on parle de bactéries anaérobies facultatives.
Une bactérie est mobile si elle peut se déplacer seule à l'aide d'un ou de plusieurs flagelles. Le degré de motilité est très important dans l'identification de certaines espèces bactériennes ^{[31]XSource de recherche}. Il y a plusieurs types d'essais de motilité, mais le moyen le plus sûr et le plus lisible est le milieu semi-solide.
Préparez une culture de bactéries dans un bouillon de culture. Suivez les instructions ci-après pour préparer le bouillon de votre choix ^{[32]XSource de recherche}.
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Inoculez la culture dans un agar semi-solide pour les tests de motilité. Enrobez une partie de la culture en bouillon d'une aiguille d'inoculation stérile. Plantez avec précaution l'aiguille dans le tube d'agar semi-solide, tel que l'agar au TTC, que vous avez préparé pour le test. L'aiguille doit pénétrer aux 2/3 de la gélose ^{[33]XSource de recherche}.
- Lorsque vous avez terminé, retirez soigneusement l'aiguille en veillant à ne pas dépasser les limites de la zone d'inoculation.
- Incubez le tube à 30 °C pendant 48 heures ^{[34]XSource de recherche}.
La gélose pour le test de motilité deviendra rouge au contact des bactéries. Si elles sont mobiles, cette teinte rouge ou rosâtre se répandra dans toute la substance. Sinon, la coloration sera limitée au site d'inoculation ^{[35]XSource de recherche}.
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Méthode 4

Méthode 4 sur 4:

Interpréter tous les résultats

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Rassemblez vos commentaires. Pour connaitre le genre de bactérie, vous devrez rassembler les informations obtenues à partir des cultures, des tests de coloration et de l'observation des formes. Si vous examinez des échantillons d'un patient, les symptômes qu'il présente peuvent également aider à déterminer le type de bactérie appropriée.
- Par exemple, si les tests montrent que les bactéries sont à Gram négatif, anaérobies, non mobiles, et que vous remarquez des symptômes comme des douleurs abdominales, des nausées et des vomissements chez le patient, il est probable que ce dernier souffre d'une infection à Bacteroides fragilis ^{[36]XSource de recherche}.
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Consultez une base de données. Il existe des milliers d'espèces de bactéries dans le monde. Il est donc impossible de tout savoir par cœur. Vous devrez probablement consulter un livre de microbiologie clinique ou une base de données en ligne pour comparer les résultats des analyses avec des informations sur les espèces bactériennes.
- Il existe d'excellentes ressources en ligne pour identifier les bactéries, mais la plupart de ces bases de données sont disponibles en anglais, notamment le site Patricbrc.org et GlobalRPh. Cependant, vous pouvez toujours trouver des informations utiles sur le site du Centre international de ressources microbiennes de l'INRA.
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Faites un test génétique pour connaitre l'espèce exacte de la bactérie. Dans certains cas, vous devrez peut-être identifier l'espèce de bactérie. La méthode la plus rapide et la plus simple consiste à effectuer un test ADN. Les tests ADN sont également utiles pour identifier les bactéries résistantes aux formes traditionnelles de coloration et de culture ^{[37]XSource de recherche}. De nos jours, les tests ADN sur les microorganismes sont très rapides et peuvent être prêts en moins de deux heures ^{[38]XSource de recherche}.
- Si vous n'avez pas accès à un laboratoire qui effectue le séquençage génétique des microorganismes, envoyez un échantillon bactérien à une institution spécialisée.
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Avertissements

Prenez toujours les précautions appropriées avant de manipuler les échantillons bactériens et les réactifs. Si vous ne vous sentez pas bien après le test, consultez immédiatement un médecin.
Les procédures ci-dessus ne doivent être effectuées que dans un laboratoire de microbiologie correctement équipé.

Cet article contient des informations médicales ou des conseils pouvant affecter votre santé.