Eine spektralphotometrische Analyse durchführen

In der Spektralphotometrie wird die Konzentration unterschiedlicher Verbindungen in einer Lösung über ihre Absorption von Licht gemessen.^{[1]XForschungsquelle} Diese Methode ist besonders mächtig, weil die einzelnen Verbindungen unterschiedliche Wellenlängen des Lichts mit unterschiedlicher Intensität absorbieren. Analysiert man das Licht nach Durchgang durch die Lösung, kann man sowohl die einzelnen Komponenten der Lösung als auch ihre Konzentrationen bestimmen. Zur Analyse von Lösungsgemischen wird im Labor ein Spektralphotometer verwendet.

Teil 1

Teil 1 von 3:

Bereite die Proben vor

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Schalte das Spektralphotometer ein. Die meisten Spektralphotometer müssen sich zunächst aufwärmen, bevor sie genaue Ergebnisse liefern können. Schalte das Gerät ein und lass es mindestens 15 Minuten lang aufwärmen, bevor du die Proben misst.
- Bereite die Proben vor, während sich das Gerät aufwärmt.
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Säubere die Küvetten oder die Teströhrchen. Wenn du das Experiment für die Schule vorbereitest, könntest du auch Einweg-Teströhrchen verwenden. Diese musst du nicht säubern. Wenn du aber Küvetten oder Mehrweg-Röhrchen verwendest, musst du sie vor Gebrauch gründlich reinigen. Spüle die Küvette mit destilliertem Wasser aus.
- Pass bei Küvetten gut auf, denn besonders Glas- oder Quarzküvetten können ziemlich teuer sein. Quarzküvetten sind für den Einsatz in der UV-vis -Spektralphotometrie vorgesehen.
- Achte darauf, dass du die lichtdurchlässigen Küvettenfenster (im Allgemeinen die durchsichtigen Seiten des Behälters) nicht anfasst.^{[2]XForschungsquelle} Wenn du sie doch ausversehen angefasst hast, solltest du die Küvette vorsichtig mit einem weichen Tuch abwischen. Achte dabei darauf, das Glas nicht zu zerkratzen.
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Fülle die Küvette mit ausreichendem Volumen der Probelösung auf. Manche Küvetten haben ein Maximalvolumen von 1 Milliliter (ml), während Teströhrchen bis zu 5 ml aufnehmen können. Dein Ergebnis wird dann genau, wenn der Laserstrahl durch die Flüssigkeit und nicht durch ein leeres Volumen im Behälter dringt.
- Wenn du deine Küvetten mit einer Pipette befüllst, solltest du für jede Probe eine neue Pipettenspitze nehmen, um Kontaminationen zu vermeiden.^{[3]XForschungsquelle}
Die Kontrolllösung, auch als Leerwert bezeichnet, enthält nur das Lösungsmittel, in welchem die zu analysierende Probe gelöst wird. Wenn du zum Beispiel in Wasser gelöstes Salz analysieren möchtest, ist Wasser deine Kontrolllösung. Wenn du das Wasser aber rot einfärbst, muss auch die Kontrolllösung rot gefärbtes Wasser sein. Die Kontrolllösung hat das gleiche Volumen wie die Probelösung und wird im gleichen Gefäß gemessen.
Bevor du die Küvette in das Spektralphotometer einsetzt, muss sie möglichst sauber sein, um Interferenzen mit Schmutz oder Staubpartikeln zu vermeiden. Entferne mit einem fusselfreien Tuch alle Wasserspritzer oder Staubpartikel auf der Außenseite der Küvette.^{[4]XForschungsquelle}
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Teil 2

Teil 2 von 3:

Führe das Experiment durch

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Wähle eine geeignete Wellenlänge, um die Probe zu analysieren und stelle sie am Spektralphotometer ein. Damit die Messung so genau wie möglich ablaufen kann, solltest du dich auf eine Wellenlänge (monochromatisches Licht) festlegen. Du musst dabei die Wellenlänge auswählen, die von einem der gelösten Stoffe absorbiert wird. Stelle die gewünschte Wellenlänge in den Einstellungen deines Spektralphotometers ein.
- In einem Schulexperiment wird dir wahrscheinlich gesagt, welche Wellenlänge du verwenden sollst.
- Weil die Probe Licht derselben Farbe reflektiert, die sie selbst aufweist, muss die Wellenlänge eine andere sein als die Farbe der Probe.
- Objekte haben eine bestimmte Farbe, weil sie Licht bestimmter Wellenlängen reflektieren und die anderen Farben absorbieren. Gras ist beispielsweise grün, weil das Chlorophyll grünes Licht reflektiert und alle anderen Wellenlängen absorbiert.
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Eiche das Gerät mit der Kontrolllösung. Platziere die Küvette mit der Kontrolllösung im Küvettenhalter und schließe die Klappe. Analoge Spektralphotometer haben eine Nadel-Anzeige, auf der sich die Nadel in Abhängigkeit der detektierten Lichtintensität bewegt. Während die Kontrolllösung gemessen wird, sollte sich die Nadel nach rechts bewegen. Notiere vorsichtshalber den angezeigten Wert und stelle die Nadel über den Drehknopf auf Null.
- Auf diese Weise werden auch digitale Spektralphotometer kalibriert. Diese haben aber eine digitale Anzeige. Stelle den Blindwert mit den Einstellknöpfen auf 0.
- Sobald du die Kontrolllösung entfernst, bleibt der Blindwert bestehen. Die Extinktion der Kontrolllösung wird automatisch von den Messwerten abgezogen, wenn du deine Proben misst.
- Achte darauf, einen Blindwert pro Messdurchgang zu verwenden, damit jede Probe mit demselben Blindwert kalibriert wird. Wenn du beispielsweise das Spektralphotometer mit einem Blindwert kalibrierst, einige Proben analysierst und danach einen neuen Blindwert verwendest, würden die restlichen Messungen ungenau sein. In diesem Fall müsstest du von vorne anfangen.
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Nimm die Kontrolllösung raus und überprüfe die Kalibrierung. Wenn sich die Kontrolllösung nicht mehr im Strahlengang befindet, sollte die Nadel oder die digitale Anzeige auf 0 (Null) bleiben. Wenn das Gerät richtig kalibriert ist und du die Kontrolllösung wieder in den Küvettenhalter steckst, sollte sich an der Anzeige nichts ändern und der angezeigte Wert auf 0 bleiben.
- Wenn die Nadel oder die Anzeige nicht 0 anzeigt, solltest du die Kalibrierung mit der Kontrolllösung wiederholen.
- Wenn weitere Probleme auftreten, solltest du dir Hilfe suchen oder das Gerät überprüfen lassen.
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Miss die Extinktion deiner Probe. Entferne die Kontrolllösung aus dem Gerät und ersetze sie durch deine Probe. Stecke die Küvette in den Küvettenhalter. Achte dabei darauf, dass sie aufrecht steht. Warte etwa 10 Sekunden lang, bis die Nadel sich stabilisiert hat oder bis sich der angezeigte Wert nicht mehr ändert. Schreibe dir die prozentuellen Werte der Transmission und/oder der Extinktion auf.
- Die Extinktion wird auch als die optische Dichte (OD) bezeichnet.
- Je mehr Licht transmittiert wird, desto weniger Licht absorbiert die Probe. Normalerweise wird die Extinktion gemessen und ihr Wert als Dezimalzahl, z.B. 0,43, angegeben.
- Wenn du einen abweichenden Wert misst (beispielsweise 0,900, obwohl die anderen Ergebnisse bei 0,400 lagen), solltest du die Probe verdünnen und die Extinktionsmessung wiederholen.
- Wiederhole die Messung mindestens 3 Mal für jede Probe und bestimme den Mittelwert der Messwerte. Dadurch wird ein genaueres Ergebnis erhalten.
Die Probe kann mehrere unbekannte Substanzen enthalten, deren Extinktion sich abhängig von der Wellenlänge ändert. Um sicherzugehen, solltest du das gesamte Spektrum messen und jede 25 nm einen Messwert aufnehmen. Dadurch kannst du auch andere Verbindungen in deiner Probe nachweisen.
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Teil 3

Teil 3 von 3:

Analysiere die gemessenen Extinktionen

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Berechne die Transmission und die Extinktion der Probe. Die Transmission gibt an, wie viel Licht das Spektralphotometer erreicht, nachdem es die Probe passiert hat. Extinktion sagt aus, wie viel Licht durch eine gelöste Verbindung ausgelöscht wurde. Oft haben moderne Spektralphotometer sowohl einen Output für Transmission als auch für Extinktion. Wenn du aber nur die Intensität misst, kannst du beide Werte berechnen.
- Die Transmission (T) wird erhalten, wenn man die Intensität des durch die Probe gewanderten Lichts durch die Intensität des Lichts durch die Kontrolllösung dividiert. Normalerweise wird der Wert als Dezimalzahl oder in Prozent angegeben. Es gilt: T = I/I₀, wobei I die Intensität nach Durchgang durch die Probe und I₀ die Intensität nach Durchgang durch die Kontrolllösung ist.
- Die Extinktion (A) ist der negative dekadische Logarithmus der Transmission: A = -log₁₀T. Für T=0,1 ergibt sich A=1 (0,1 ist 10 hoch -1). Das bedeutet, dass 10% des Lichts transmittiert und 90% absorbiert werden. Für T=0,01 ist A=2 (0.01 ist 10 hoch -2). Das heißt, dass nur 1% des Lichts transmittiert werden.
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Zeichne den Graphen der Extinktion in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Die Extinktion wird auf der vertikalen y-Achse in Abhängigkeit von der verwendeten Wellenlänge auf der horizontalen x-Achse aufgetragen. Durch die Auftragung der maximalen Extinktion bei jeder Wellenlänge wird das Absorptionsspektrum der Probe erhalten. Mit diesem können sowohl die Bestandteile der Lösung als auch ihre Anteile identifiziert werden.
- Üblicherweise hat ein Absorptionsspektrum Banden bei bestimmten Wellenlängen, anhand denen du die Komponenten bestimmen kannst.
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Vergleiche dein Absorptionsspektrum mit Spektra bekannter Verbindungen. Jede Verbindung hat ein einzigartiges Absorptionsspektrum und weist bei jeder Messung einen Peak bei gleicher Wellenlänge auf. Wenn du deine Auftragungen für die unbekannten Verbindungen mit Graphen bekannter Verbindungen vergleichst, kannst du die Bestandteile deiner Lösung bestimmten.
- Mit dieser Methode kannst du auch feststellen, ob deine Probe kontaminiert ist. Etwas stimmt nicht mit deiner Probe, sobald du eine einzige scharfe Bande bei einer bestimmten Wellenlänge erwartest und stattdessen zwei Banden bei unterschiedlichen Wellenlängen misst.
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