Cómo hacer una tinción de Gram

La tinción de Gram es un procedimiento rápido que se usa para buscar la presencia de bacterias en muestras de tejidos y caracterizarlas como Gram positivas o Gram negativas en base a las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares.^{[1]XFuente de investigaciónBergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath. (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Novena edición). Lippincott Williams & Wilkins.} La tinción de Gram casi siempre debe realizarse como el primer paso en el diagnóstico de una infección bacteriana.

La tinción de Gram se llama así por el científico danés Hans Christian Gram (1853 – 1938), quien desarrolló la técnica en 1882 y la publicó en 1884 como una técnica para distinguir entre dos tipos de bacterias con síntomas clínicos similares: las bacterias Streptococcus pneumoniae (también conocida como neumococo) y Klebsiella pneumoniae.^{[2]XFuente de investigaciónGram, HC. (1884). Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten (en alemán). Fortschritte der Medizin 2: 185–9.}

Parte 1

Parte 1 de 3:

Preparar el portaobjetos

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Colócate guantes y amárrate el cabello si lo tienes largo para evitar contaminar la muestra de bacteria que vayas a analizar. Desinfecta un espacio de trabajo debajo de la campana extractora o en otra área bien ventilada. Antes de comenzar, revisa que el mechero Bunsen y el microscopio estén operativos.
Si el portaobjetos está sucio, lávalo con agua jabonosa para eliminar la grasa y la suciedad. Desinféctalo con etanol, limpiador de vidrios o el método que recomiende tu laboratorio.
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Coloca la muestra en el portaobjetos. Puedes usar el método de la tinción de Gram para ayudar a identificar las bacterias presentes en muestras médicas o en cultivos de bacterias en una placa de Petri. Para que la tinción de Gram sea útil, coloca una capa delgada de la muestra sobre el portaobjetos. Es recomendable una muestra que tenga menos de 24 horas, ya que las bacterias más antiguas pueden tener paredes celulares dañadas que responderán de forma menos predecible a la tinción de Gram.^{[3]XFuente de investigación}
- Si vas a usar una muestra de tejido, coloca de 1 a 2 gotas de la muestra en el portaobjetos de vidrio. Extiéndela uniformemente sobre el portaobjetos para formar una mancha delgada usando el borde de un segundo portaobjetos de vidrio esterilizado. Deja que se seque con el aire antes de continuar.
- Si vas a tomar bacterias de una placa de Petri, esteriliza un asa bacteriológica en la llama de un mechero Bunsen hasta que brille, luego deja que se enfríe. Úsala para colocar una gota de agua esterilizada sobre el portaobjetos y luego esteriliza y enfría el asa otra vez antes de transferir una pequeña muestra de bacteria al portaobjetos y revolverla suavemente en el agua.^{[4]XFuente de investigación}
- Las bacterias en un medio de cultivo deben mezclarse en un agitador de vórtice y luego colocarse en el portaobjetos con un asa bacteriológica, como se indica anteriormente, pero sin agregar el agua adicional.^{[5]XFuente de investigación}
- Si tienes una muestra en un hisopo, pásalo ligeramente por encima del portaobjetos.^{[6]XFuente de investigación}
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Fija la muestra por calor. El calor fijará las bacterias al portaobjetos de forma que no se enjuaguen tan fácilmente durante la tinción. Pasa rápidamente el portaobjetos dos o tres veces por la llama de un mechero Bunsen o caliéntalo sobre un calentador de portaobjetos eléctrico. No lo sobrecalientes o las muestras podrían distorsionarse. Si vas a usar un mechero Bunsen, la llama debe ser un cono pequeño y azul, no uno alto y anaranjado.^{[7]XFuente de investigación}
- Alternativamente, la muestra puede fijarse con metanol, agregando 1 o 2 gotas sobre la mancha seca, drenando el exceso de metanol y dejando que se seque con el aire. Este método minimiza el daño a las células huésped, dándoles un fondo más limpio.
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Posiciona el portaobjetos en una bandeja para tinción. Una bandeja para tinción es una bandeja poco profunda de metal, vidrio o plástico con una pequeña malla o soporte de alambre a lo largo de la parte superior. Coloca el portaobjetos sobre este soporte de forma que los líquidos que vayas a usar puedan drenarse sobre la bandeja.
- Si no tienes una bandeja para tinción, el portaobjetos puede colocarse directamente sobre una cubeta de plástico para hielo.^{[8]XFuente de investigación}

Parte 2

Parte 2 de 3:

Realizar la tinción de Gram

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Empapa la muestra con cristal violeta. Usa una pipeta para empapar la muestra de la bacteria con varias gotas de tinte cristal violeta, a veces llamado violeta de genciana. Espera de 30 a 60 segundos. En una solución acuosa, el cristal violeta (CV) se disocia en CV+ e iones de cloruro (Cl-). Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de células tanto Gram positivas como Gram negativas. El ion CV+ interactúa con los componentes con carga negativa de las células bacterianas para mancharlas de violeta.
- Muchos laboratorios usan el cristal violeta de "Hucker", el cual agrega oxalato de amonio para evitar la precipitación.^{[9]XFuente de investigación}
Inclina el portaobjetos y usa un matraz de lavado para rociar un pequeño chorro de agua destilada o de grifo sobre la parte superior del portaobjetos. El agua debería escurrirse sobre la superficie de la mancha pero no estar apuntada directamente a ella.^{[10]XFuente de investigación} No enjuagues excesivamente, lo cual puede quitar la tinción de las bacterias Gram positivas.
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Empapa la mancha con yodo y luego enjuaga. Usa una pipeta para cubrir la mancha con yodo. Déjala reposar por lo menos por 60 segundos, luego enjuágala cuidadosamente con el mismo método.^{[11]XFuente de investigación} El yodo, en la forma de iones con carga negativa, interactúa con los iones CV+ para formar grandes compuestos de cristal violeta y yodo (compuestos CV-I) dentro de las capas interiores y exteriores de la célula. Esto atrapa el color del cristal violeta en la célula, en el lugar en el que la haya teñido.
- El yodo es corrosivo. Evita su inhalación, ingestión o contacto con la piel.
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Agrega un decolorante y luego enjuaga rápidamente. Para este paso crítico, se usa normalmente una mezcla de acetona y etanol en una proporción de 1:1. La realización de este paso debe calcularse cuidadosamente. Sujeta el portaobjetos en ángulo, luego agrega el decolorante hasta que nada del color violeta sea visible en la escorrentía. Esto normalmente toma menos de 10 segundos o incluso menos tiempo si el decolorante contiene una alta concentración de acetona. Detente inmediatamente o el decolorante retirará la tinción de cristal violeta de células tanto Gram positivas como Gram negativas y la tinción tendrá que repetirse. Enjuaga inmediatamente el exceso de decolorante usando la técnica mencionada anteriormente.
- Puede usarse acetona pura (95%+) en su lugar.^{[12]XFuente de investigación} Mientras más acetona haya, el decolorante trabajará más rápido, lo que requerirá un cálculo más preciso del tiempo.
- Si estás teniendo problemas para calcular la realización de este paso, considera agregar el decolorante gota a gota.^{[13]XFuente de investigación}
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Empapa la mancha con un colorante secundario y luego enjuaga. Se usa un colorante secundario, normalmente safranina o fucsina, para agregar un contraste adicional entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, tiñendo las bacterias decoloradas (Gram negativas) de rosado o rojo.^{[14]XFuente de investigaciónBeveridge, TJ; Davies, JA. (Noviembre de 1983). "Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain". Revista de bacteriología 156 (2): 846–58.}^{[15]XFuente de investigaciónDavies, JA; Anderson, GK; Beveridge, TJ; Clark, HC. (Noviembre de 1983). "Chemical mechanism of the Gram stain and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy which replaces the iodine mordant of the stain". Revista de bacteriología 156 (2): 837–45.} Deja el colorante en la muestra por lo menos por 45 segundos, luego enjuágalo.^{[16]XFuente de investigación}
- La fucsina teñirá muchas bacterias Gram negativas de forma más intensa, como las especies Haemophilus y Legionella.^{[17]XFuente de investigación} Esto puede convertirla en una mejor opción para principiantes.
Puedes dejar que el portaobjetos se seque con el aire o secarlo usando papel absorbente que se venda para este propósito.^{[18]XFuente de investigación} La tinción de Gram está terminada.

Parte 3

Parte 3 de 3:

Examinar el resultado

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Prepara el microscopio óptico. Coloca el portaobjetos bajo el microscopio óptico. Las bacterias varían en gran medida en tamaño, así que la magnificación total requerida variará de 400x a 1000x.^{[19]XFuente de investigación} En el extremo más alto de estas magnificaciones, se recomienda usar una lente objetiva con aceite de inmersión para una mayor claridad. Coloca una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos, evitando el movimiento durante la aplicación para evitar las burbujas.^{[20]XFuente de investigación} Mueve el revólver del microscopio de forma que la lente objetiva se posicione en su lugar con un clic, tocando el aceite.
- El aceite de inmersión solo puede usarse en lentes diseñadas especialmente, no en una lente "seca".
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Identifica las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Examina el portaobjetos bajo el microscopio óptico. Las bacterias Gram positivas se verán violetas debido al cristal violeta atrapado en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram negativas se verán rosadas o rojas, ya que el violeta se enjuagó a través de las delgadas paredes celulares y luego ingresó a ellas el colorante secundario rosado.
- Si la muestra es demasiado gruesa, puedes obtener falsos positivos. Tiñe una nueva muestra si todos tus resultados son Gram positivos, para asegurarte de que el resultado sea correcto.
- Si el decolorante se escurrió por mucho tiempo, puedes obtener falsos negativos. Tiñe una nueva muestra si todos tus resultados son Gram negativos para revisar los resultados dos veces.
Si no estás seguro de lo que es una bacteria, busca en colecciones de imágenes referenciales clasificadas por forma y resultado de la tinción de Gram. Puedes encontrar bases de datos en línea en la Base de Datos Nacional de Patógenos Microbianos de los EE. UU., Bacterias en fotos y muchos otros sitios. Para facilitar más la identificación, los ejemplos comunes o importantes para el diagnóstico están clasificados a continuación por estado de Gram y forma.
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Identifica bacterias Gram positivas por su forma. Las bacterias se clasifican más a fondo por su forma bajo el microscopio, más comúnmente como cocos (esféricas) o varas (cilíndricas). Estas son algunas bacterias Gram positivas (teñidas de violeta) comunes clasificadas por forma:
- Los cocos Gram positivos generalmente son ya sea estafilococos (que significa cocos en grupos) o estreptococos (que significa cocos en cadenas).
- Las varas Gram positivas incluyen los bacilos y las bacterias Clostridium, Corynebacterium y Listeria. Las varas de la especie Actinomyces a menudo tienen ramas o filamentos.^{[21]XFuente confiablePubMed CentralIr a la fuente}
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Identifica bacterias Gram negativas. Las bacterias Gram negativas (teñidas de rosado) a menudo se clasifican en tres grupos. Los cocos son las bacterias esféricas, las varas son las bacterias largas y delgadas, y las varas cocoides están en un punto intermedio.
- Los cocos Gram negativos son más comúnmente la especie Neisseria.
- Las varas Gram negativas incluyen las bacterias E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas y muchas otras. La bacteria Vibrio cholerae puede aparecer como varas normales o varas curvas.^{[22]XFuente de investigación}
- Las varas Gram negativas "cocoides" (o "cocobacilos") incluyen la Bordetella, Brucella, Haemophilus y Pasteurella.
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Evalúa los resultados mixtos. Algunas bacterias son difíciles de teñir con precisión debido a la fragilidad de sus paredes celulares o a cuán cerosas sean. Pueden tener una mezcla de una tinción violeta o rosada en la misma célula o entre diferentes células en la misma muestra. Cualquier muestra de bacteria que tenga más de 24 horas puede tener este problema, pero algunas especies son difíciles de teñir a cualquier edad. Pueden requerir pruebas más especializadas para reducir el número de posibilidades para su identificación, como la tinción de Ziehl-Neelsen, la observación del crecimiento de cultivos, el agar TSI o pruebas genéticas.^{[23]XFuente de investigación}
- Las especies Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium y Propionibacterium se consideran bacterias Gram positivas, pero a menudo aparecen teñidas de forma no concluyente.^{[24]XFuente de investigación}
- Las bacterias pequeñas y delgadas, como las especies Treponema, Chlamydia y Rickettsia, son difíciles de teñir correctamente.^{[25]XFuente de investigación}
Los procedimientos para la eliminación de desechos varían entre laboratorios y según los materiales usados. Normalmente, el líquido en la bandeja para tinción se desecha como residuo peligroso en botellas selladas. Sumerge los portaobjetos en una solución con un 10 % de lejía y luego deséchalos en recipientes para instrumentos afilados.

Consejos

Recuerda que el rendimiento de la tinción de Gram es solo tan bueno como el espécimen. Es importante enseñar a los pacientes a proporcionar buenos especímenes (por ejemplo, enseñarles la diferencia entre un escupitajo y una tos profunda para muestras de esputo).
Como decolorante, el etanol actúa con más lentitud que la acetona.
Sigue las precauciones estándar para el laboratorio.
Usa un frotis bucal para practicar, ya que la muestra debe contener bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas. Si solo ves uno u otro tipo de bacteria, es probable que hayas usado muy poco o demasiado decolorante.^{[26]XFuente de investigación}
Puedes usar una pinza para ropa de madera con resortes para sujetar el portaobjetos.^{[27]XFuente de investigación}

Advertencias

La acetona y el etanol son inflamables y la acetona resecará tus manos. Usa guantes y manipúlalos con precaución.
No dejes que la mancha se seque antes de enjuagar el tinte o el colorante secundario.^{[28]XFuente de investigación}